Le génie tissulaire viendra remplacer l’utilisation d’animaux de laboratoire en recherche biomédicale ?

Introduction

Les 1er et 2 avril 2009 s’est tenue à Londres une conférence internationale intitulée « Tissue engineering : a new dimension to animal replacement ». Organisée par le NC3Rs (National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of animals in Research) et le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, conseil de recherche pour les biotechnologies et les sciences biologiques), cette conférence visait à rassembler des chercheurs travaillant dans cette discipline en plein essor. Elle a ainsi permis d’évaluer les avancées scientifiques ayant pour but de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les laboratoires à des fins de recherche biomédicale.

La culture in vitro de cellules de mammifères permet aux chercheurs d’étudier leur activité, de modéliser et d’évaluer leurs orientations biologiques, de tester de nouvelles molécules et ainsi de faire avancer le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Bien entendu, les conditions environnementales, qui jouent un rôle crucial sur la structure, la physiologie et le comportement cellulaire, sont largement différentes in vitro ou in vivo. Le plus grand défi de l’ingénierie tissulaire est donc de mimer ou recréer in vitro les modèles qui puissent être représentatifs de la situation existant in vivo.

Au total, près de 150 délégués se sont retrouvés, représentant 59 institutions britanniques. Le compte-rendu de ces deux journées de conférences, où se sont succédés 22 orateurs, présentera un état des lieux de l’ingénierie tissulaire : sa capacité à modéliser les pathologies humaines accompagnée d’exemples d’applications déjà existantes, ses applications commerciales, l’utilisation des cellules souches en augmentation, et finalement les défis auxquels elle doit encore faire face aujourd’hui pour remplir les promesses qui ont été placées en cette nouvelle technologie.

Le National centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs)

Créé en 2004, ce centre finance la recherche biologique, biotechnologique et biomédicale dont l’ultime objectif est la réduction, le raffinement et le remplacement des animaux de laboratoires utilisés à des fins de recherche. L’investissement a augmenté d’une année sur l’autre depuis sa création : 2,6 millions de livres alloués en 2008 contre 500 000 livres en 2004. Le gouvernement, par le biais de la Comprehensive Spending Review (CSR), devrait continuer d’augmenter les budgets du Medical Research Council (MRC, Conseil pour la recherche biomédicale) et du BBSRC à des fins de recherche sur les 3Rs. Le NC3Rs est également financé par les secteur privé et le secteur caritatif.
L’établissement des 3Rs au Royaume-Uni commence à avoir un impact sur le reste de la communauté de recherche, en raison notamment des publications 3Rs qui commencent à arriver. D’autres laboratoires changent leurs pratiques, notamment dans les domaines de la recherche cardiovasculaire et de la cicatrisation
Le NC3Rs finance cette recherche via deux filières principales que sont un programme de grants accordées pour une durée allant jusqu’à trois ans et un programme de petites bourses. Dix grants ont été allouées en 2008 (environ 20 % de succès) : en plus de l’appel blanc, deux domaines de recherche avaient été soulignés comme spécifiquement importants par le NC3Rs—les 3Rs chez le poisson et l’amélioration des animaleries de rongeurs incluant soins et procédures. Les petites subventions permettent quant à elles de soutenir des efforts plus restreints et notamment de la recherche d’information ou des visites d’échanges. La troisième voie de financement a démarré en avril 2009 et allouera des bourses de thèses.

1. Modélisation de pathologies

1.1 L’animal de laboratoire : un modèle mal adapté aux pathologies humaines

La création du Centre NC3Rs était importante non seulement parce qu’il existe un fort lobby pour la protection des animaux au Royaume-Uni, mais aussi parce que les modèles animaux utilisés sont trop souvent peu ou mal appropriés aux pathologies humaines étudiées. Il est donc toujours plus pressant de développer et d’optimiser des modèles alternatifs qui soient plus adaptés que les modèles animaux existants. Parmi de nombreux exemples, notons celui de l’utilisation de chevaux et/ou de chiens pour l’étude de la dégénérescence des cartilages du genou : ces animaux, quadrupèdes, ne peuvent reproduire les forces exercées sur le genou qui existent chez l’Homme…

1.2 Le génie tissulaire : vers le développement de nouveaux modèles plus adaptés ?

L’alternative actuelle provient du génie tissulaire, une discipline à l’interface entre les sciences de l’ingénieur et les sciences biologiques qui présente un double objectif : d’une part, celui d’obtenir des cultures cellulaires en 3D, qui sont de meilleurs modèles in vitro que leurs équivalents en 2D (monocouches) encore utilisés dans la majorité des cas, et, d’autre part, celui de maintenir, réparer ou reconstruire des tissus ou organes, en particulier lorsque des cellules souches sont utilisées comme matériel de départ. Les cultures cellulaires en 3D pourraient être de bons modèles tissulaires, utilisés par exemple à des fins pharmacologiques ou toxicologiques pour tester de nouveaux agents thérapeutiques. Dans l’exemple ci-dessus de la dégénérescence du cartilage du genou, un tel système in vitro ne reproduit bien entendu pas les forces physiques exercées sur le genou, mais il présente l’avantage d’expérimenter directement sur du tissu humain. A l’heure actuelle, il existe plusieurs modèles viables à petite échelle mais qui doivent toutefois être améliorés, démontrer leur fiabilité et devenir bon marché pour entrer dans les laboratoires de recherche.

Ces nouvelles techniques et ces nouveaux produits présentent de nombreux intérêts. D’une part ils viennent minimiser les inconvénients présentés par les cultures cellulaires en monocouche, qui n’acquièrent jamais le phénotype ou le comportement des mêmes cellules in vivo. D’autre part ils permettent de réduire, raffiner et remplacer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. Le génie tissulaire est donc un domaine prioritaire et, à ce titre, a reçu près de 50 % des grants distribuées en 2008 par le NC3Rs.

1.3 Quelques exemples d’applications existantes

• Modélisation des atteintes de moelle épinière conduisant à des paralysies à l’aide de cultures mixtes de neurones du système nerveux central (SNC, glie et axones) ayant développé des couches de myéline, et capables de mimer le tissu intact in vivo. Ces cultures seront utilisées pour tester des agents thérapeutiques visant à réparer la moelle épinière en favorisant l’élongation des axones dans la zone endommagée.
• Les problèmes d’arthrose sont causés principalement par la perte et la dégénérescence du cartilage articulaire, pour lesquelles la meilleure thérapie est une greffe autologue (du patient lui-même) de chondrocytes, ces cellules formant le cartilage. Les scientifiques s’attèlent donc à créer des cultures en 3D, à l’aide de cellules provenant des abattoirs voisins de leur laboratoire.
• Les infections généralisées, ou septicémies , ont toujours un mauvais pronostic de rétablissement avec près de 45 % des patients qui décèdent à l’hôpital (chiffres NHS, 2004). Un nouveau système 3D de tubules rénaux permet aujourd’hui d’étudier le tissu rénal et les dommages occasionnés en réponse à un épisode de septicémie. Ce système repose sur une matrice contenant du collagène et les cellules en croissance développent et s’arrangent en kystes creux et tubules, mimant les fonctionnalités observées in vivo.
• Pour les plaies chroniques touchant 15 à 20 % des patients diabétiques (plaies qui peuvent rester à vif durant plusieurs années), qui ne peuvent être reproduites chez un modèle animal, une approche par ingénierie tissulaire offrirait la possibilité de développer un système à haut débit pour comprendre les mécanismes défaillants. De tels systèmes n’ont pas encore été développés mais les systèmes de cultures en 2D sont aujourd’hui relativement avancés et faciliteront leur développement : il a notamment été découvert que les fibroblastes provenant de plaies chroniques ne présentent pas le même phénotype que des fibroblastes normaux, et que leur capacité à migrer est très diminuée.

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Plaque pour culture cellulaire à 24 puits
Crédit : adamjtaylor ; cc (attribution and Sharelike)

• Afin de pouvoir remplacer la muqueuse buccale de patients atteints de cancers de la tête et du cou, des scientifiques ont mis au point un modèle de culture tissulaire en 3D contenant de l’épithélium oral stratifié, qui repose sur une matrice de tissu conjonctif, elle-même faite de fibroblastes buccaux. Ce modèle est utilisé pour tester la réponse de la muqueuse à des attaques variées (infections, tabac, matériel dentaire, etc.) ou à l’introduction de cellules cancéreuses malignes. Ces expériences ont permis notamment de répliquer des tumeurs solides de la tête et du cou et d’étudier de tels cancers à toutes les étapes de leur développement.
• Le tassement des disques intervertébraux conduit à des douleurs dorsales importantes, et aucune approche thérapeutique n’est entièrement satisfaisante à l’heure actuelle. Des scientifiques tentent de recréer, par génie tissulaire, ces disques intervertébraux pour d’une part restaurer la hauteur de disques nécessaire au soutien de la colonne vertébrale et d’autre part tester de nouveaux agents thérapeutiques.
• Des études sont en cours pour développer un modèle humain de barrière hémato-encéphalique pour améliorer les connaissances et la compréhension de la migration des cellules cancéreuses passant dans le cerveau.
Etude du SNC  : plusieurs compagnies de Biotech. utilisent des cultures de tranches de cerveau organotypique (cultures n’ayant pas besoin de support solide). Si les résultats obtenus sont satisfaisants à petite échelle, le débit de ces systèmes est encore restreint et devra être très largement amélioré pour qu’ils soient adoptés comme un outil incontournable dans l’étude du cerveau et le développement à grande échelle de nouveaux médicaments du SNC.
Régénération du foie  : bien que le foie soit l’organe présentant la plus grande capacité de régénération, il a été impossible jusqu’alors de reproduire cette caractéristique in vitro, car elle est régulée par des voies de signalisation impliquant non seulement des hépatocytes mais également des cellules endothéliales et de nombreux facteurs solubles transportés par la circulation sanguine. Un système test en 3D et vascularisé a donc été créé : dans les vaisseaux circule le milieu de culture dont la pression, le flux et la pulsation sont régulés par modélisation informatique pour simuler la circulation sanguine. Ce système a démontré la capacité du tissu in vitro à fonctionner comme le foie pour un certain nombre de caractéristiques et peut donc être utilisé pour tester la pharmacologie et la toxicologie de nouvelles molécules, à petite échelle.

En raison de l’entrée en vigueur de la directive européenne sur les cosmétiques en 2013 qui interdira les tests répétés sur animaux à des fins de recherche en cosmétique, des laboratoires travaillent au développement in vitro de tissus en 3D qui seront utilisés pour les tests toxicologiques. Certains systèmes sont d’ores et déjà satisfaisants et miment correctement les réponses biologiques observées dans le poumon chez l’Homme.

L’utilisation des microplaques de cultures en 2D est largement acceptée par la communauté scientifique et pharmaceutique. Seuls des progrès considérables en termes de développement de nouveaux systèmes plus appropriés viendront supplanter les cultures en 2D qui offrent une faible valeur prédictive dans les expériences de pharmacologie, de toxicologie et de développement. Des sociétés de Biotech. travaillent au développement de bioréacteurs à plusieurs compartiments qui permettront le transfert direct des protocoles depuis les microplaques, sans nécessiter de modification des conditions de cultures.

Exemples de systèmes pour la culture cellulaire en 3D

En 5 ou 6 ans, la société de Biotech. ReInnervate Ltd a mis au point, en collaboration avec des physiciens et des ingénieurs, une plateforme technologique permettant le développement de tissus en 3D de manière routinière. Ceci est d’autant plus important en neurosciences qu’il a été démontré que les neurones, en culture monocouche, n’atteignent jamais le stade de neurones complètement différenciés. Par conséquent, leur physiologie in vitro reste un mauvais modèle de la situation in vivo. Les scientifiques utilisent un support inerte et stable de 200mm d’épaisseur et dont les pores présentent une taille prédéfinie et contrôlée. Par ailleurs, le système développé offre également la possibilité de superposer plusieurs tissus, qui viennent s’organiser les uns par rapport aux autres de la même façon qu’ils le feraient in vivo. Cette technologie a démontré son efficacité dans la stratification et la croissance de couches de peau artificielle, les couches inférieures portant les marqueurs de peau immature et les couches supérieures ceux de la peau mature et différenciée. http://www.reinnervate.com/
La société de Biotech. Kirkstall Ltd. a, quant à elle, développé un système de culture cellulaires en 3D pour des cellules de mammifères dépourvues de matrice. La technologie utilisée crée plusieurs centaines de micro-puits dans la surface d’un hydrogel non-adhésif (tel l’agarose). Les cellules, placées directement sur l’hydrogel sur lequel elles ne peuvent s’attacher, s’agglutinent ensemble pour former un micro-tissu. En fonction de la forme donnée au micro-puits, le micro-tissu sera sphéroïdal, toroïdal en bâtonnet, ou en nid d’abeille. Les scientifiques ont également démontré que cette technologie est viable lorsque plusieurs types cellulaires sont placés sur le gel, en ce que l’assemblage est automatique et ressemble à ce qui est observable in vivo. http://www.kirkstall.org/

2. Applications commerciales

2.1 L’ingénierie tissulaire présente un intérêt commercial

D’une manière générale, il existe 5 étapes scientifiques dans le développement de nouvelles molécules en médicaments potentiels :
• la découverte d’une nouvelle molécule ;
• l’analyse de cette molécule dans un système simple in vitro  ;
• la confirmation des résultats in vivo chez un modèle animal ;
• l’expérimentation chez un nombre restreint de volontaires humains (essai clinique de phase 1) ;
• l’investigation chez un grand nombre de volontaires humains (essai clinique de phase 3)
Cette séquence, connue et suivie par tous, a cependant démontré son inefficacité au cours de ces dernières années, notamment si l’on se base sur la très faible proportion de molécules perçant sur le marché du médicament. Le maillon faible de cette séquence est l’étape 3, inefficace - voire néfaste - pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Les modèles animaux ont en effet une physiologie différente de la physiologie humaine et les études pharmacologiques ou toxicologiques menées sur ces modèles ne sont pas nécessairement représentatives de (et peuvent parfois être en totale opposition à) la physiologie humaine. L’ingénierie de tissus humains, tout en éliminant l’étape in vivo animale, offre la possibilité de tester les nouvelles molécules directement sur du tissu humain, et apporte ainsi une information pertinente de façon plus rapide. Le développement de molécules non satisfaisantes ou s’avérant dangereuses pourraient alors être stoppées plus en amont de la séquence décrite ci-dessus, ce qui accélèrerait le développement, réduirait les dépenses engagées et les problèmes éthiques liés à l’utilisation d’animaux de laboratoires. Les scientifiques sont donc confiants que l’avenir appartient au génie tissulaire.

2.2 Les questions de réglementation

Au cours de cette conférence, il a été entendu que les produits et systèmes en 3D développés par génie tissulaire ne remplaceront pas rapidement l’utilisation des animaux de laboratoire ; en effet, la communauté scientifique estime qu’il faudra entre 5 et 7 ans aux instances réglementaires pour accepter puis valider ces systèmes comme modèles alternatifs aux modèles animaux. Par ailleurs, cette même communauté s’inquiète du fait que ces système en 3D seront testés, leur efficacité jugée comme « bon modèle d’étude » et validés sur la base d’une comparaison avec des modèles qui ne sont pas adéquats – les modèles animaux.

3. Les cellules souches

L’avancée des recherches sur les cellules souches et l’augmentation presque exponentielle de leur utilisation présentent une approche très prometteuse pour les 3Rs. Certains imaginent déjà que les questions éthiques pourraient disparaître si les cellules induced-Pluripotent Stem Cell (iPS, cellule souche pluripotente induite) répondent aux attentes qui ont été placées en elles.
Les cellules souches sont des cellules pluripotentes (capables de se différencier en n’importe quel type de cellules de l’organisme) ou multipotentes (capables de se différencier en un nombre restreint de cellules de l’organisme) dont la division asymétrique mène à une cellule fille qui entre dans le cycle cellulaire normal et subit les étapes de différentiation, et une cellule fille qui reste sous la forme de cellule souche. Leur utilisation en ingénierie tissulaire est révolutionnaire car donnant accès à une grande quantité de matériel pour mener les études de pharmacologie et de toxicologie in vitro, matériel qui serait difficilement collecté à partir de donneurs. Par ailleurs, un type de cellule souche nouvellement décrit, iPS, correspond à un type cellulaire à qui l’on a fait « remonter le temps » : une cellule différenciée telle qu’une cellule de peau est ainsi forcée, à l’aide d’un cocktail de facteurs chimiques, à redevenir une cellule souche, qui pourra alors être différenciée en un autre type cellulaire de l’organisme. Ces cellules iPS devraient permettre de créer rapidement des modèles de maladies, qui pourront être associés non seulement à la mutation responsable de la pathologie mais également à l’histoire clinique de l’individu. Un large screening d’environ 10 000 patients permettrait d’identifier au sein de cette cohorte quels patients sont les plus appropriés pour servir de modèle type. Ces modèles amélioreront de manière non négligeable la pharmacologie et la toxicologie prédictives ainsi que l’identification de nouveaux bio-marqueurs. De plus, on peut imaginer que ces cellules iPS pourraient un jour offrir une approche thérapeutique individualisée qui éviterait notamment les problèmes de rejet immunologique de greffes.

Le Dr Philip Wright, directeur Général de SC4SM (Stem Cells for Safer Medicines, cellules souches pour des médicaments plus sûrs), a présenté les défis et les chances que présentent les cellules souches dans ces nouvelles technologies d’ingénierie tissulaire, et mis l’accent sur le potentiel qu’elles offrent pour les études pharmacologiques et toxicologiques dans le développement de nouveaux agents thérapeutiques. En raison des coûts liés à l’utilisation d’animaux de laboratoire et du phénomène d’attrition de plus en plus marqué, le SC4SM a lancé un programme de financement pour faciliter le développement de programmes de recherche fléchés se concentrant sur l’hépato-toxicité et la cardio-toxicité. Les résultats attendus touchent à la validité des cellules différenciées, la reproductibilité des techniques, l’extensibilité de ces techniques vers une grande échelle et la prédiction. L’objectif est de créer une banque de cellules souches contenant les génotypes et séquences génotypiques connus et impliqués dans le métabolisme des agents thérapeutiques. Pour plus d’information sur le SC4SM, voir les actualités scientifiques au Royaume-Uni de février 2008, p. 19.


Dr Claire Mouchot

publié le 02/07/2009

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